ELISA方法的建立中包被浓度的问题

ELISA方法的建立中包被浓度的问题

包被浓度一般通过方阵ELISA来确定。

经典的方阵ELISA是将抗原和抗体各自稀释成不同梯度浓度，结果将OD值P/N>2的均判为阳性，选取OD值在1.0左右的那个Ag-Ab浓度为*佳工作浓度，

但是，对于抗原抗体而言，由于它们被稀释成不同浓度，那么在理论上，每个抗原稀释度下，总有一个抗体的稀释度其OD值在1.0左右，那么到底选取哪一个OD值1.0左右的好呢？这就需要同时用**做个抑制来看，也就是说,每个抗原抗体稀释度下,需要同时做间接及间接竞争ELISA.哪个浓度下抑制情况好，就取哪个抗原抗体浓度做工作浓度.

ELISA问题我总结了一下,你们可以去看看.

我碰到过所有孔都一样蓝的情况，从两方面找原因了：

一是调整酶的浓度。ELISA反应中酶是关键因素之一，酶浓度高会导致P/N比拉不开。处理：在别的条件不变的情况下，对酶做梯度稀释，10倍一个梯度。酶稀释到了合适的浓度，结果一下就好看了。

二是排除封闭不好的问题。我用过自己配的BSA封闭和国外试剂盒配的封闭液，虽不是天上人间的差别，至少也是清晰与模糊的距离。这个虽然不是关键问题，在试验不好又找不到突破的时候，也别放过可能的失误吧。

你可以通过方阵实验，确定抗原抗体的*佳结合浓度。

具体的方法：将抗原稀释成不同梯度的浓度包被，抗体也稀释成不同的浓度梯度，加二抗，显色。一般选OD值在1.0左右的抗原抗体结合浓度。

你还有什么具体的要求，说清楚一点，再帮你解答。

逐点分析啊：

就你包被的单抗来说，对于标准品来说已经是远远过量了，所以这个梯度对于你的实验来说，没有起到相应的作用。

标准品的总梯度也不够大，不过8倍而已，建议增加梯度。同理一抗的梯度，因为如果你的蛋白比较大，即使是1：2000稀释也足以结合掉所有的标准品了，板子一片蓝也就不可避免了。

另外关于封闭液，不知你用的是什么，如果是BSA应该不会有问题。

把生物素二抗加HRP 的系统直接换成了HRP结合的二抗，结果不是一片蓝了，可看出浓度梯度。但是空白还是比较高，OD值在0.3--0.6左右。结果样本测定均小于空白值。

重新用10%FBS封闭过夜，结果BSA PBS孔（空白对照）为0.373, PBS孔0.45, FBS PBS 孔0.309。样本还是大部分低于空白。但是如果样本以FBS 孔为空白（样本为细胞培养上清，都含有10%FBS)，则部分样本有结果。