细胞培养相关问题及解答
细胞培养相关问题及解答
小牛血清和胎牛血清有何区别？应用注意事项？
来源不同：胎牛血清(Fetal Bovine Serum ,FBS) 是在屠宰怀孕母牛的时候,通过心脏穿刺采血获取的胎牛的血清，新生牛（小牛）血清（Calf serum, CS）采自出生10至14 天的小牛。
组份与比例不同：两者所含的促细胞生长因子、促贴附因子、**及其他活性物质等组份与比例不同，用途与用法不同：某些细胞必需胎牛血清才能生长，而有些细胞只需小牛血清即可，使用浓度不同，一般在5%-10%，有特殊要求的浓度在20%。
血清保存和使用须注意：血清应保存在-5℃至-20℃，若存放在4℃不可超过一个月。解冻血清时，应先将血清至于2-8℃冰箱，并经常摇匀使之溶解，然后至室温放置使之升温，优良不可将冷冻的血清直接放入37℃水浴或者温箱中，如放在37℃解冻，颜色加深，粘稠度也会增加，血清在解冻和热灭活后，应按用量分装并于-20℃保存，避免反复冻融。
胰酶消化传代的浓度是多少？是否含EDTA？浓度？
胰酶消化传代的一般浓度为0.25%，部分细胞由于贴壁较紧，需要加0.53mM 的EDTA，如果做原代培养，胰酶的浓度需要做适当的提高。
常用细胞株推荐的培养基及特殊要求？
常规培养基的选用一般原则，悬浮培养细胞以RPMI1640为主、贴壁培养的细胞以DMEM为主，部分细胞需用特殊培养液来培养，如Mccoy’5A、L-15、F12K、D+F12 等等。
细胞株的污染鉴定、预防和处理问题。
普通微生物污染：培养基浑浊，高倍镜观察有微生物污染；按规定弃用并**严格**。
支原体污染：显微镜无法观察，依经验表现为细胞生长缓慢，有细胞漂浮等等，应通过pcr 等方法鉴定，如发现支原体污染，应按规定弃用，实验室要及时******，防止蔓延。（有些常规性细胞学实验不受支原体污染影响，可以继续使用细胞传代，为防污染扩大蔓延，可以选择性的在培养基中加入高效价的其它种***，并在隔离实验室操作和独立使用一切用具与培养基等）。
如何传代贴壁细胞？
细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。一般使用蛋白水解酶（比如胰蛋白酶）消化贴壁细胞成单个细胞，也可加入乙二胺四乙酸（EDTA）提高消化能力，EDTA 是一种二价离子的螯合剂，能抑制细胞膜上的Ca2+和Mg2+。常用的细胞消化液一般含有0.25%(w/v)的胰酶和0.03% (w/v) EDTA，一般用不含Ca2+和Mg2+的盐溶液配置，先用胰酶-EDTA 消化液清洗细胞（5.0 -10.0 ml/75cm），然后弃去消化液，重新加入少量的胰酶-EDTA 消化液(2.0 to 5.0 ml/75 sq. cm flask)，观察细胞直到细胞变圆脱离瓶壁，此过程一般需要5-15分钟，为了避免细胞成团，消化细胞的过程中不要拍打细胞瓶。对于特别难消化的细胞，可以加入胰酶EDTA 消化液后把细胞置于37°C 促进消化，细胞脱离瓶壁后，立刻加入含有血清的完全培养基中止消化，血清中某些蛋白质能够抑制胰酶的活性。
一般情况下，离心并不需要。如果细胞需要无血清或者低血清的培养基，可以以125000g 转速离心5分钟，然后弃去中止用的培养基，加入适合的新的培养基轻轻混匀细胞，移入到新的培养瓶。传代的比例视细胞类型而定，一般是1:2-1:20，具体比例可参考说明书。胰蛋白酶会对某些细胞的细胞膜产生损伤，对于这种类型的细胞，可用细胞刮轻轻刮下细胞，加入适量的培养基，轻轻吹打混匀细胞，然后进行传代培养。
传代细胞的频率多久较合适？
传代是指把细胞从一个培养瓶移到另一个培养瓶，传代的间隔是指两次传代之间的时间。
贴壁型的细胞的汇合度达到或者接近100%的时候，需进行传代操作，但是，有些细胞以克隆的形式生长，汇合度永远达不到100%，对于这种类型的细胞，细胞达到或者接近*大密度的时候，就需传代。接触抑制型细胞（比如3T3）需要在细胞长满之前传代以避免产生细胞长满后接触抑制后产生性状的改变。悬浮型的细胞必须在细胞达到*大饱和密度之前传代，悬浮细胞传代时只需稀释至合适的密度，让细胞有充足的营养恢复到对数生长期。
如果仅仅是简单的换液，而且细胞数量不减少，细胞将会快速耗尽营养而死亡；如果细胞稀释到*低密度之下，细胞将会进入停滞期而不增殖或者死亡。不同的悬浮细胞的*大饱和密度和传代的间隔与比例是不同的，所以，培养悬浮细胞要每日观察。
如何处理对于生物安全性不清楚地肿瘤细胞株？
了解每株细胞可能产生的生物危害是很难的，但是强烈推荐，所有的人类和其他灵长类生物的细胞在能否预防HIV和肝炎病毒的实验条件下操作，所有的操作必须在垂直层流超净台内操作（推荐生物安全柜），操作过程中产生的废液和废仪器都要经过清洗、酸处理等处理后才能丢弃。
能否使用细胞说明书上不同的培养基来培养细胞？
产品目录或者细胞说明书上的推荐的培养基一般是细胞株的原始提供者推荐的培养基或者已经经过验证的对该细胞株*合适的培养基，细胞对未推荐的培养基也许会适应，也有可能不适应。对于更换培养基，应谨慎对待，更换培养基时，应留一瓶细胞使用推荐的培养基培养，留作种子。
更换培养基有两种方法，*简单的方法是直接更换培养基，强制使细胞适应新的培养基；还有一种更温和的方法：传代细胞的时候分成细胞两瓶，**瓶使用原来推荐的培养基，**瓶使用50%原来推荐的培养基，50%新的培养基，之后仔细观察细胞的生长状态，如果**瓶细胞生长状态不好，应立即停止更换培养基，如果**瓶生长状态好，可以继续传代分瓶，一瓶使用50%原来推荐的培养基，50%新的培养基，另一瓶使用25%原来推荐的培养基，75%新的培养基，继续观察，如果细胞状态好，可以全部换成新鲜的培养基。
