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磷酸化蛋白Western Blot的注意事项

日期:2022-07-05 17:24
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摘要: 磷酸化蛋白Western Blot的注意事项 关于/磷酸化蛋白样品,裂解液问题 蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应,所以取样品的过程要迅速,样品要新鲜,样品处理*好在冰上操作,操作时间尽量短。用PBS洗涤细胞时,PBS一定要4℃预冷。如果是组织的话,提取蛋白时采用液氮研磨的方法,研磨器具*好提前预冷,保持低温的状态。 提取磷酸化蛋白的裂解液*好是新鲜配制,裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,否则即使条带压出来也会很浅,结果也...

磷酸化蛋白Western Blot的注意事项

磷酸化蛋白Western Blot的注意事项

  • 关于/磷酸化蛋白样品,裂解液问题
  • 蛋白的磷酸化是一个非常迅速的反应,所以取样品的过程要迅速,样品要新鲜,样品处理*好在冰上操作,操作时间尽量短。用PBS洗涤细胞时,PBS一定要4℃预冷。如果是组织的话,提取蛋白时采用液氮研磨的方法,研磨器具*好提前预冷,保持低温的状态。
  • 提取磷酸化蛋白的裂解液*好是新鲜配制,裂解液中一定要有蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂,否则即使条带压出来也会很浅,结果也不可信。okadaic acid,NaF是磷酸酶抑制剂。再者,还要看你检测的蛋白磷酸化位点是什么氨基酸,如果是酪氨酸还要加1 u M的sodium vanidate即原钒酸钠,上样前不要煮沸,煮沸可能会破坏其磷酸化位点。
  • 提取的磷酸化蛋白一定要妥善保存,*好是收集完成后马上变性并于-80℃分装保存,以保证降解程度*小。同时避免反复冻溶导致磷酸基团的降解。
  • 关于/Western Blot操作问题
  • 磷酸化蛋白的表达丰度较低,一般只有总蛋白量的10%,甚至更低,一定要确保每个凝胶孔中有足够的目的蛋白上样量。
  • 磷酸化蛋白容易脱磷酸化,除提取蛋白时要迅速小心外,也可在上样缓冲液和转移缓冲液中加入磷酸化酶抑制剂Na3VO4等。
  • 磷酸化抗体的好坏是一个关键因素,所以要选择好的厂商。好抗体,傻瓜也能做出来,不好的抗体神仙也无办法。有些公司的抗体很好,有些公司的抗体很差(一些大公司同样会有低劣产品),而且这一点对非磷酸化的抗原检测也很重要。
  • 因为磷酸化蛋白只占总蛋白量的极少部分,加入一抗后*好4℃过夜,保证抗体有充分的结合时间。4℃也可以使一抗重复使用多次。毕竟磷酸化抗体都挺贵的。二抗则室温1h即可。4℃过夜,主要原因不是使抗体结合更好,而是蛋白抗原不容易从膜上脱落。蛋白抗原在膜上靠的是物理吸附属热力学范畴,高温下容易脱落。而抗体-抗原结合是热力学与动力学问题,高温容易结合是热力学范畴,抗体、抗原浓度却是动力学范畴。膜上的抗原脱落了,结合效率会低。
  • 磷酸化蛋白WB时,用洗涤液漂洗时也要注意一下,摇床的转速不要太快,洗的时间不要太长,孵育一抗和二抗之后分别洗3次,每次5min即可。宁愿深一些,总比做不出来强得多。另外,洗的时候,*好不要把几张膜叠在一起洗。
  • 关于/磷酸化抗体的说明书
  • 磷酸化抗体的说明书大家一定要仔细看,并*好根据厂商的操作说明来操作实验,这是实验成功的保证。因为不同的磷酸化抗体公司推荐的操作步骤不同。比如upstate的gamma-H2AX就需要脱脂奶粉封闭,一抗、二抗也需要脱脂奶粉配制;而CST的一些抗体则是脱脂奶粉封闭,一抗、二抗用BSA配制。其中原因不详,但是应该是非常关键的,我试过用BSA配gamma-H2AX,背景很高,目的条带非常淡。
  • 关于/WB时背景和条带的问题
  • 磷酸化蛋白WB时背景也往往较深,所以压片时间要适当,不能太长或过短,太长则背景太深盖住想要的那条带,时间过短则可能没有条带或者条带太浅。
  • 洗涤液对*后的背景影响也较大,密理博(millipore)*近的说明书推荐用双蒸水洗涤,我对比了TBST洗涤的膜,效果有一定差距,背景有效降低,即便压片30min,背景仍然是可以忽略的。我想,双蒸水充分减少了ECL反映中其他缓冲液的影响,应该是可取的。
  • 做磷酸化蛋白WB时,除了目标蛋白的条带以外,往往会出现非特异性的条带。磷酸化抗体不好的话,甚至会压出非特异性的条带,反而没有你想要的条带,所以压片后,一定要根据Markers比对一下你压出的条带分子量是否正确。
  • 关于/蛋白总的表达量问题
  • 研究完某一蛋白的磷酸化情况后*好也要研究一下该蛋白总的表达量。这有两种方法,一是:相同的样品在不同的孔中上样两次(可在相同的胶上,也可在不同的胶上),其一压磷酸化蛋白,另一压该蛋白总的表达量(包括磷酸化和未磷酸化的该蛋白),甚至还可跑另一个胶,压内标。但是一般不建议如此做,因为这样比较时误差还是较大的。因此,比较公认的,也是常用的方法,即用strip液将原先结合上的磷酸化抗体及二抗洗去,然后用同一张膜压总蛋白。然后再洗脱一次,再压内标。
  • 关于/Strip时的问题
  • Strip时一定要注意,膜一定要完全泡在strip solution中(可用较硬的塑料膜封好),然后要完全浸入水中,使受热均匀。这一点很重要,要不然,随后压出来的总蛋白也好,内标也好就会不均一,无法进行比较。
  • strip液是用来去除已结合的抗体,但也会去除部分的蛋白,导致蛋白信号变弱。实验发现水浴有时温度不稳定,温度定为55℃时往往其温度容易超过,导致较多的蛋白也被去除,故建议温度设为50℃,30min,既能有效去除已结合的抗体,又比55℃更能保护蛋白。

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